Thiết kế quy trình phát hiện steroid tổng hợp trong nước tiểu bằng GC–MS/MS. a. Mô tả bước tiền xử lý (hydrolysis, chiết, derivatization) trước chạy GC–MS/MS. b. Nêu cách lập đường chuẩn, dùng internal...

Để thiết kế quy trình phát hiện steroid tổng hợp trong nước tiểu bằng GC–MS/MS, chúng ta sẽ đi qua từng bước một cách chi tiết. ### a. Bước tiền xử lý 1. **Thủy phân (Hydrolysis)**: - Lấy mẫu nước tiểu và thêm một lượng enzyme thủy phân (như glucuronidase) để phá vỡ các liên kết glucuronide của steroid trong mẫu. - Nung mẫu ở nhiệt độ 37 độ C trong vòng 1-2 giờ để đảm bảo quá trình thủy phân hoàn tất. 2. **Chiết xuất (Extraction)**: - Sử dụng phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction - LLE) hoặc chiết xuất pha rắn (solid-phase extraction - SPE). - Nếu sử dụng LLE, thêm dung môi như ethyl acetate vào mẫu nước tiểu đã thủy phân, khuấy đều và ly tâm để tách lớp. Lớp dung môi sẽ chứa các steroid. - Nếu sử dụng SPE, cho mẫu nước tiểu qua cột SPE đã được hoạt hóa. Sau đó, rửa cột bằng dung môi thích hợp để loại bỏ tạp chất và thu hồi steroid bằng cách elute bằng dung môi mạnh. 3. **Chuyển hóa (Derivatization)**: - Để cải thiện độ nhạy và khả năng phát hiện, thực hiện bước chuyển hóa các steroid thành các dẫn xuất. - Sử dụng một loại chất chuyển hóa như BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) để derivat hóa các hydroxyl nhóm của steroid. - Nung mẫu sau khi thêm chất chuyển hóa trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ 70-80 độ C. ### b. Lập đường chuẩn và xác định ngưỡng phát hiện 1. **Lập đường chuẩn**: - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn với nồng độ steroid khác nhau (ví dụ: 1, 10, 50, 100 ng/mL). - Chạy các dung dịch chuẩn qua GC–MS/MS và ghi nhận diện tích đỉnh của mỗi nồng độ. - Vẽ biểu đồ diện tích đỉnh so với nồng độ để tạo đường chuẩn (phương trình đường thẳng y = ax + b). 2. **Sử dụng internal standard**: - Chọn một internal standard đồng vị cho mỗi steroid. Ví dụ, có thể sử dụng steroid đồng vị đã biết (như D3-testosterone). - Thêm một lượng cố định của internal standard vào mỗi mẫu và dung dịch chuẩn trước khi chiết xuất. - Tính toán nồng độ steroid trong mẫu bằng cách so sánh diện tích đỉnh của mẫu với diện tích đỉnh của internal standard. 3. **Xác định ngưỡng phát hiện**: - Xác định ngưỡng phát hiện (LOD) bằng cách sử dụng các mẫu với nồng độ thấp và tìm nồng độ thấp nhất có thể phát hiện với độ chính xác và độ nhạy chấp nhận được. - Thực hiện phân tích để tính LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên tiếng ồn (S/N) khoảng 3:1 hoặc 10:1. ### c. Yếu tố pháp lý và chuỗi lưu trữ mẫu 1. **Yếu tố pháp lý**: - Đảm bảo rằng quy trình phân tích tuân thủ các quy định và tiêu chuẩn pháp lý hiện hành, chẳng hạn như luật pháp về xét nghiệm doping hoặc quy định của các tổ chức thể thao. - Ghi chép chi tiết về phương pháp, kết quả, và bất kỳ vấn đề nào phát sinh trong quá trình phân tích. 2. **Chuỗi lưu trữ mẫu (Chain of custody)**: - Mẫu nước tiểu phải được thu thập và lưu trữ một cách an toàn để đảm bảo tính toàn vẹn. Mỗi mẫu cần được đánh dấu rõ ràng với thông tin về người thu thập, thời gian thu thập và vị trí thu thập. - Tạo một hồ sơ chi tiết về quá trình lưu trữ mẫu, bao gồm ai đã xử lý mẫu, khi nào và ở đâu. Điều này đảm bảo rằng không có sự can thiệp nào vào mẫu từ khi thu thập đến khi phân tích. - Đảm bảo mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ thích hợp (thường là -20 độ C hoặc -80 độ C) để tránh sự phân hủy của steroid. Với quy trình trên, chúng ta có thể phát hiện steroid tổng hợp trong nước tiểu một cách hiệu quả và chính xác.