cách xác định mạch gốc cả genGiúp mình với!

Dưới đây là một số cách thông dụng (cả in silico lẫn thực nghiệm) để xác định mạch gốc (template strand) của toàn bộ một gen: 1. Xác định ORF (Open Reading Frame) trên trình tự DNA (in silico) - Lấy trình tự DNA tháo thành hai chuỗi (chuỗi “+” và chuỗi “–”). - Trên mỗi chuỗi, dịch mã giả (theo khung đọc 1, 2, 3) để tìm ORF đủ điều kiện (bắt đầu bằng ATG, kết thúc bằng TAA/TAG/TGA, chiều dài hợp lý). - Chuỗi nào cho ORF hợp lệ và liên tục (khung đọc không bị “dập vỡ”) theo chiều 5’→3’ thì đó chính là chuỗi mã (“coding” hoặc sense strand). - Mạch gốc (template) chính là mạch đối diện và mang hướng 3’→5’ so với ORF vừa tìm được. 2. Tìm các yếu tố điều hòa (promoter) (in silico) - Ở vi khuẩn, tìm vùng consensus –35 (TTGACA) và –10 (TATAAT) cách điểm khởi đầu phiên mã khoảng 35 và 10 bp. - Ở sinh vật nhân chuẩn, tìm TATA box (khoảng –25…–30 bp), CAAT box, GC box… - Hướng của các Motif này cho bạn biết RNA polymerase bám vào mạch nào (mạch gốc sẽ được quét từ 3’→5’ để tổng hợp mRNA 5’→3’). 3. Đối chiếu với mRNA đã biết hoặc với protein (in silico) - Nếu đã có trình tự mRNA (hoặc cDNA), bạn chỉ cần căn chỉnh (alignment) mRNA với vùng genome: mạch không giống hệt mRNA (nhưng ngược bổ sung) chính là mạch gốc. - Ngoài ra, dịch trình tự hai mạch rồi BLAST với database protein để xem chuỗi nào cho kết quả trùng khớp. 4. Sử dụng RNA-seq hoặc các kỹ thuật định vị phiên mã (thực nghiệm) - Đọc cao trình tự RNA-seq, map lên genome: chỉ những reads định hướng (strand-specific RNA-seq) sẽ cho biết mRNA xuất phát từ mạch nào → mạch kia là template. - Kỹ thuật primer extension, S1 nuclease protection, RNase protection assay… xác định vị trí và hướng mRNA, từ đó suy ra mạch gốc. 5. Tóm tắt quy trình chung khi chưa có dữ liệu mRNA: (1) Scan hai mạch tìm ORF chuẩn. (2) Xác định promoter/xu hướng ORF. (3) Chuỗi cho ORF theo chiều 5’→3’ là coding strand, đối diện là mạch gốc (template). Chú ý: - Mạch gốc luôn được RNA polymerase “đọc” theo chiều 3’→5’ để tổng hợp mRNA 5’→3’. - Mạch mã (coding/sense) có trình tự gần giống mRNA (T thay bằng U) và có chiều 5’→3’ cũng trùng với chiều mRNA. Nếu bạn có trình tự cụ thể, bạn có thể dùng phần mềm như ORF Finder, GenScan, Prodigal (cho vi khuẩn) hoặc công cụ alignment với mRNA để xác định ngay mạch gốc. Chúc bạn thành công!