Thiết kế quy trình sắc ký để tách và xác định một peptide ngắn có tính tích điện trong dung dịch. a. Chọn kiểu sắc ký (RP-HPLC hay Ion-exchange) và giải thích cơ sở lựa chọn. b. Viết bước chuẩn bị mẫu,...

a. Lựa chọn kiểu sắc ký và cơ sở lý luận
Để tách và xác định một peptide ngắn có tính tích điện trong dung dịch, bạn có hai lựa chọn chính là Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) và Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchange).

Tôi sẽ chọn Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC).

Cơ sở lựa chọn: Mặc dù peptide có tích điện, nhưng RP-HPLC vẫn là lựa chọn hàng đầu cho việc tách các peptide.

Tính linh hoạt: RP-HPLC hoạt động dựa trên tương tác kỵ nước giữa peptide và pha tĩnh. Hầu hết các peptide, kể cả peptide ngắn, đều có một số vùng kỵ nước. Bằng cách điều chỉnh thành phần pha động, ta có thể kiểm soát được mức độ tương tác này để đạt được sự tách biệt hiệu quả.

Hiệu suất cao: RP-HPLC có độ phân giải cao và tốc độ tách nhanh, rất phù hợp cho việc phân tích các mẫu phức tạp.

Khả năng tương thích với MS: RP-HPLC dễ dàng kết hợp với đầu dò khối phổ (MS), cho phép xác định khối lượng chính xác của peptide, một bước cực kỳ quan trọng để xác nhận danh tính.

Sắc ký trao đổi ion cũng có thể được sử dụng vì peptide có tích điện, nhưng nó thường được dùng để tinh chế các peptide hoặc protein lớn hơn. Đối với các peptide ngắn, RP-HPLC thường mang lại hiệu quả tốt hơn về độ phân giải và tốc hợp tách.

b. Chuẩn bị mẫu, điều kiện pha động và phát hiện
1. Chuẩn bị mẫu
Hòa tan: Peptide được hòa tan trong dung dịch có pH và nồng độ thích hợp, thường là dung dịch axit loãng (ví dụ: nước chứa 0,1% axit trifluoroacetic - TFA) để đảm bảo peptide tan hoàn toàn và ở dạng proton hóa, duy trì tính ổn định.

Lọc: Dung dịch mẫu cần được lọc qua màng lọc có kích thước lỗ nhỏ (ví dụ: 0,22 µm) để loại bỏ các hạt rắn, bảo vệ cột sắc ký.

2. Điều kiện pha động
Pha tĩnh: Cột sắc ký RP-HPLC thường được đóng gói bằng silica đã được biến tính bề mặt với các nhóm kỵ nước như C 
18
​
 hoặc C 
8
​
.

Pha động:

Pha A: Nước cất chứa 0,1% TFA. TFA hoạt động như một chất điều chỉnh pH và cũng là một ion ghép cặp (ion-pairing agent) giúp tăng độ phân giải bằng cách tương tác với các nhóm tích điện của peptide.

Pha B: Acetonitrile (hoặc methanol) chứa 0,1% TFA.

Chế độ rửa giải: Sử dụng chương trình rửa giải theo gradient, bắt đầu với tỷ lệ pha B thấp (ví dụ 5-10%) và tăng dần lên (ví dụ 60-70%) để rửa giải các peptide có tính kỵ nước mạnh.

3. Phát hiện
Đầu dò UV/Vis: Đây là đầu dò phổ biến và cơ bản nhất. Hầu hết các peptide đều có khả năng hấp thụ ánh sáng UV, đặc biệt là ở bước sóng 214 nm (liên kết peptide) và 280 nm (amino acid thơm như Tryptophan, Tyrosine).

Đầu dò Khối phổ (MS): Đây là phương pháp phát hiện mạnh mẽ và không thể thiếu để xác định peptide.

ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry): Peptide được ion hóa thành các ion tích điện dương và được phân tích theo tỷ lệ khối lượng/điện tích (m/z).

ESI-MS/MS: Đây là phương pháp phân tích sâu hơn, giúp xác định trình tự peptide. Các ion peptide được chọn lọc, phân mảnh và sau đó phân tích các mảnh vỡ.

c. Cách xác nhận trình tự peptide
Để xác nhận trình tự của peptide, phương pháp thủy phân cắt chuỗi + MS/MS là một kỹ thuật mạnh mẽ.

Thủy phân cắt chuỗi:

Sử dụng các enzyme thủy phân protein (protease) chuyên biệt, như trypsin, để cắt peptide thành các mảnh nhỏ hơn. Trypsin cắt tại các vị trí của amino acid lysine (K) và arginine (R).

Quá trình này tạo ra một "dấu vân tay" đặc trưng về khối lượng của các mảnh peptide.

Phân tích MS/MS:

Đưa các mảnh peptide từ bước thủy phân vào máy khối phổ MS/MS.

Trong buồng va chạm, các mảnh peptide này sẽ bị "va đập" và vỡ ra. Các mảnh vỡ này có một mô hình vỡ đặc trưng, cho phép suy luận ngược lại để xác định trình tự amino acid ban đầu.

Các phần mềm chuyên dụng (ví dụ: Mascot, Sequest) sẽ so sánh dữ liệu MS/MS thu được với các cơ sở dữ liệu trình tự peptide để tìm ra trình tự khớp nhất.